酶聯免疫吸附測定實驗(ELISA)的操作流程

　　Elisa 操作流程(以人IL-4 ELISA KIT為例)：

　　檢測原理:

　　本實驗采用雙抗體夾心ELISA法?？谷薎L-4單抗包被于酶標板上，標本和標準品中的IL-4會 與單抗結合，游離的成分被洗去。加入生物素化的抗人IL-4抗體和辣根過氧化物酶標記的親 和素。生物素與親和素特異性結合;抗人IL-4抗體與結合在單抗上的人IL-4結合而形成免疫 復合物，游離的成分被洗去。加入顯色底物，若反應孔中有IL-4，辣根過氧化物酶會使無色 的顯色劑現藍色，加終止液變黃。在450nm處測OD值，IL-4濃度與OD450值之間呈正比，可 通過繪制標準曲線求出標本中IL-4的濃度。

　　試劑盒組成：

　　1.抗體預包被酶標板(8×12 或 8×6)

　　2.凍干標準品(2 / 1 支;0.5ng/支)

　　3.標準品和標本稀釋液(橙蓋瓶)(1 瓶;20ml/12ml)

　　4.濃縮生物素化抗體(紫蓋瓶)(1 支)

　　5.生物素化抗體稀釋液(藍蓋瓶)(1 瓶;16ml/10ml)

　　6.濃縮酶結合物(棕蓋瓶)(1 支)

　　7.酶結合物稀釋液(紫蓋瓶)(1 瓶;16ml/10ml)

　　8.濃縮洗滌液 20× (白蓋瓶)(1 瓶;50ml/25ml)

　　9.顯色底物(TMB)(棕蓋瓶)(1 瓶;12ml/6ml)

　　10.反應終止液(紅蓋瓶)(1 瓶;12ml/6ml)

　　11.封板膠紙(6/3 張)

　　12.產品說明書(1 份)

　　酶聯免疫試劑盒標本收集:

　　1. 收集血液的試管應為一次性的無熱原，無內毒素試管。

　　2. 血漿抗凝劑推薦使用EDTA。避免使用溶血，高血脂標本。

　　3. 標本應清澈透明，懸浮物應離心去除。

　　4. 標本收集后若不及時檢測，請按一次使用量分裝，凍存于-20℃，-70℃電冰箱內，避免反復凍融，3-6月內檢測。

　　5. 如果您的樣本中檢測物濃度高于標準品最高值，請根據實際情況，做適當倍數稀釋(建 議做預實驗，以確定稀釋倍數)。

　　酶聯免疫試劑盒 注意事項:

　　1. 試劑盒使用前請保存在2-8℃。復溶后的標準品應分裝后，將其放在-20～-70℃貯存。

　　2. 濃縮生物素化抗體，濃縮酶結合物體積小，運輸中顛簸和可能的倒置，會使液體沾到管壁 或瓶蓋。因此使用前請用手甩幾下或1000轉/分離心1分鐘，以使附著管壁或瓶蓋的液體沉積到管底。取用前，請用移液器小心吹打4-5次使溶液混勻。

　　3. 從冰箱中取出的濃縮洗滌液可能有結晶,屬于正?，F象，微加熱至40℃使結晶溶解后 再配制洗滌液。(加熱溫度不要超過50℃)使用時洗滌液應為室溫。

　　4. 若需要分次使用標準品應按照每一次用量分裝，將其放在-20～-70℃貯存。避免反復凍 融。

　　5. 不同批號的試劑盒組份不能混用(洗滌液和反應終止液除外)。

　　6. 充分輕微混勻對反應結果尤為重要，最好使用微量振蕩器(使用頻率)，如無微量振蕩器，可在反應前手工輕輕敲擊酶標板框混勻。

　　7. 在試驗中標準品和樣本檢測時建議作雙孔檢測。

　　8. 試驗中所用的試管和吸頭均為一次性使用，嚴禁在不同的液體之間混用!否則將影響試 驗結果。

　　9. 試驗中請穿著試驗服并帶乳膠手套做好防護工作。特別是檢測血液或者其他體液標本時， 請按國家生物試驗室安全防護條列執行。

　　檢測前準備工作:

　　1. 請提前20分鐘從冰箱中取出試劑盒，以平衡至室溫。

　　2. 將濃縮洗滌液用雙蒸水稀釋(1:20)。未用完的放回4℃。

　　3. 標準品: 加入標準品/標本稀釋液0.5ml至凍干標準品中，靜置15分鐘，待其充分溶解后，輕輕混勻(濃度為1000 pg/ml)。然后根據需要進行稀釋。(建議標準曲線使用以下濃度： 1000、500、250、125、62.5、31.25、15.6、0 pg/ml)。復溶標準品原液(1000 pg/ml)若未用完請分裝后放入-20℃以下電冰箱內保存，保存兩個月。已稀釋的標準品請廢棄。

　　4. 生物素化抗體工作液：按當次試驗所需要得用量，使用前20分鐘，以生物素化抗體稀釋液稀釋濃縮生物素化抗體(1:30)成工作濃度。當日使用。若實驗次數過多導致生物素化 抗體量不足，可向我們公司單獨購買生物素化抗體。(須提供抗體批號)

　　5. 酶結合物工作液：按當次試驗所需要得用量，使用前20分鐘，以酶結合物稀釋液稀釋濃 縮酶結合物(1:30) 成工作濃度。當日使用。若實驗次數過多導致濃縮酶結合物量不足， 可向我們公司單獨購買濃縮酶結合物。(須提供酶結合物批號)

　　酶聯免疫試劑盒洗滌方法:

　　1. 自動洗板機：要求注入的洗滌液為350ul，注入與吸出間隔15-30秒。洗板5次。

　　2. 手工洗板：甩盡孔內液體，在潔凈的吸水紙上拍干，每孔加洗滌液350ul，靜置30秒后甩盡液體，在厚迭吸水紙上拍干。洗板5次。

　　操作步驟:

　　1.從已平衡至室溫的密封袋中取出試驗所需板條，未用的板條和干燥劑請放回鋁箔袋內壓 實自封條，密封口袋，放回4℃。

　　2.空白孔加標準品和標本稀釋液，其余相應孔中加標本或不同濃度標準品(100ul/孔)，用封板膠紙封住反應孔，36℃孵箱孵育90分鐘。

　　3.提前20分鐘準備生物素化抗體工作液。

　　4.洗板5次。

　　5.空白孔加生物素化抗體稀釋液，其余孔加入生物素化抗體工作液(100ul/孔)。用新封板膠紙封住反應孔，36℃孵箱孵育60分鐘。

　　6.提前20分鐘準備酶結合物工作液。避光室溫(22-25 ) ℃ 放置。

　　7.洗板5次。

　　8.空白孔加酶結合物稀釋液，其余孔加入酶結合物工作液(100ul/孔)。用新封板膠紙封住反應孔，36℃孵箱，避光孵育30分鐘。

　　9.打開酶標儀電源，預熱儀器，設置好檢測程序。

　　10.洗板5次。

　　11.加入顯色底物(TMB)100ul/孔，避光36℃孵箱，避光孵育15分鐘。

　　12.加入終止液100ul/孔, 混勻后即刻測量OD450值(3分鐘內)。在儀器保存讀數結果并打印一份紙質結果。

　　13.實驗完畢后將未用完的試劑按規定的保存溫度放回電冰箱保存至有效期結束。

　　建議保存酶標板框，以備下次或者今后試驗使用。

　　結果判斷:

　　1. 每個標準品和標本的OD值應減去空白孔的OD值。

　　2. 手工繪制標準曲線。以標準品濃度作橫坐標，OD值作縱坐標，以平滑線連接各標準品的坐標點。通過標本的OD值可在標準曲線上查出其濃度。

　　3. 若標本OD值高于標準曲線上限，應適當稀釋后重測，計算濃度時應乘以稀釋倍數。

　　靈敏度、特異性和重復性:

　　● 靈敏度：最小可測人IL-4達7pg/ml。

　　● 特異性：不與IL-1,2,3,5,6,8,10,12,IFN,TNF及sTNF-RII等反應。

　　● 重復性：板內，板間變異系數均<10%。

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